Genetic profiling of ApoE in dementia

A demência é uma das principais causas de incapacidade entre os idosos, afetando mais de 36 milhões de pessoas em todo o mundo. É caracterizada pela deterioração progressiva das funções cognitivas, resultando em dificuldades no desempenho das atividades diárias do indivíduo. A idade de aparecimento dos sintomas, bem como a sua taxa de progressão, são variáveis entre a maior parte das demências, sendo estas geralmente caracterizadas por uma natureza progressiva, aumentando de gravidade ao longo do tempo. Entre os tipos mais frequentes de demência encontram-se a Doença de Alzheimer (DA), Demência Vascular, Demência de Corpos de Lewy e Demência Frontotemporal. O diagnóstico diferencial das demências é realizado tipicamente por testes neuro-psicológicos (para a exclusão de outras demências) e por exames imagiológicos. Contudo, muitos dos sintomas clínicos característicos podem sobrepor-se entre os diversos tipos de demência, o que pode constituir um problema devido a falta de especificidade e erros de diagnóstico. A compreensão dos fatores de risco ambientais e genéticos que podem modular o aparecimento e/ou progressão de doenças abre novas perspetivas relativamente à gestão destas neuropatologias. O gene da apolipoproteína E (ApoE) é reconhecido como o maior fator de risco na demência, desempenhando um papel central em particular no desenvolvimento da DA, sendo que os portadores do alelo ε4 são mais suscetíveis para a doença. Além disso, possíveis associações foram também propostas entre este gene e outras doenças neurológicas, sendo no entanto estes dados ainda controversos. Assim, o objetivo principal deste trabalho consistiu em determinar as frequências alélicas e genotípicas do gene ApoE num grupo de estudo piloto de pacientes com demência na região de Aveiro. Este grupo foi subdividido com base no diagnóstico neuroquímico, no qual foram avaliados os níveis de Aβ1-42, Tau-total e fosfo-Tau 181 no líquido cefalorraquidiano dos pacientes. Como resultado, observou-se que o alelo ε3 foi o mais frequente no grupo total, independentemente do tipo de patologia, e que o alelo ε2 foi o menos comum. O alelo ε4 foi de facto mais frequente em pacientes com DA do que em pacientes com outras neuropatologias, o que está de acordo com a relação proposta por outros autores. Adicionalmente, foi possível verificar que a frequência deste alelo nos pacientes com patologia amilóide é semelhante à observada no grupo DA, sugerindo um papel relevante para o ApoE no metabolismo e acumulação cerebral do Aβ. Consequentemente, estes indivíduos podem ter uma maior suscetibilidade para o desenvolvimento de DA no futuro. Deste modo, os nossos dados corroboram a ideia de que o alelo ε4 é um forte fator de risco para a DA e que deve ser considerado como um teste genético relevante que pode contribuir para o diagnóstico clínico da demência.

Comparison of different methods to detect genetic barriers in a small mammal population

Habitat fragmentation and the consequently the loss of connectivity between populations can reduce the individuals interchange and gene flow, increasing the chances of inbreeding, and the increase the risk of local extinction. Landscape genetics is providing more and better tools to identify genetic barriers.. To our knowledge, no comparison of methods in terms of consistency has been made with observed data and species with low dispersal ability. The aim of this study is to examine the consistency of the results of five methods to detect barriers to gene flow in a Mediterranean pine vole population Microtus duodecimcostatus: F-statistics estimations, Non-Bayesian clustering, Bayesian clustering, Boundary detection and Simple/Partial Mantel tests. All methods were consistent in detecting the stream as a non-genetic barrier. However, no consistency in results among the methods were found regarding the role of the highway as a genetic barrier. Fst, Bayesian clustering assignment test and Partial Mantel test identifyed the highway as a filter to individual interchange. The Mantel tests were the most sensitive method. Boundary detection method (Monmonier’s Algorithm) and Non-Bayesian approaches did not detect any genetic differentiation of the pine vole due to the highway. Based on our findings we recommend that the genetic barrier detection in low dispersal ability populations should be analyzed with multiple methods such as Mantel tests, Bayesian clustering approaches because they show more sensibility in those scenarios and with boundary detection methods by having the aim of detect drastic changes in a variable of interest between the closest individuals. Although simulation studies highlight the weaknesses and the strengths of each method and the factors that promote some results, tests with real data are needed to increase the effectiveness of genetic barrier detection.

Molecular study of cell degeneration and evolution induced by mRNA mistranslation

As proteínas existentes nas células são produzidas pelo mecanismo de tradução do mRNA, no qual a informação genética contida nos genes é descodificada em cadeias polipeptídicas. O código genético, que define as regras de descodificação do genoma, minimiza os erros de tradução do mRNA, garantindo a síntese de proteínas com elevada fidelidade. Esta é essencial para a estabilidade do proteoma e para a manutenção e funcionamento dos processos celulares. Em condições fisiológicas normais, os erros da tradução do mRNA ocorrem com frequências que variam de 10-3 a 10-5 erros por codão descodificado. Situações que aumentam este erro basal geralmente estão associadas ao envelhecimento, stresse e a doenças; no entanto, em certos organismos o código genético é traduzido naturalmente com elevado erro, indicando que a síntese de proteínas aberrantes pode de algum modo ser vantajosa. A fim de estudar a resposta celular aos erros de tradução do mRNA, construímos leveduras que incorporam serina no proteoma em resposta a um codão de leucina, usando a expressão constitutiva de um tRNASer mutante. Este fenómeno genético artificial provocou uma forte diminuição da esporulação, da viabilidade e da eficiência de mating, afectando imensamente a reprodução sexual da levedura. Observou-se também uma grande heterogeneidade no tamanho e na forma das células e elevada instabilidade genómica, com o aparecimento de populações poliplóides e aneuplóides. No sentido de clarificar as bases celulares e moleculares daqueles fenótipos e compreender melhor a biologia do erro de tradução do mRNA, construímos também células de levedura que inserem serina em resposta a um codão de leucina de modo indutível e controlado. Utilizaram-se perfis de mRNA total e de mRNA associado a polissomas para elucidar a resposta celular ao erro de tradução do mRNA. Observou-se a indução de genes envolvidos na resposta ao stresse geral, stresse oxidativo e na unfolded protein response (UPR). Um aumento significativo de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e um forte impacto negativo na capacidade das células pós-mitóticas re-iniciarem o crescimento foram também observados. Este fenótipo de perda de viabilidade celular foi resgatado por scavangers de ROS, indicando que o stresse oxidativo é a principal causa de morte celular causada pelos erros de tradução. Este estudo levanta a hipótese de que o stresse oxidativo e a acumulação de ROS, ao invés do colapso súbito do proteoma, são as principais causas da degeneração celular e das doenças humanas associadas aos erros de tradução do genoma. ABSTRACT: Proteins are synthesized through the mechanism of translation, which uses the genetic code to transform the nucleic acids based information of the genome into the amino acids based information of the proteome. The genetic code evolved in such a manner that translational errors are kept to a minimum and even when they occur their impact is minimized by similar chemical properties of the amino acids. Protein synthesis fidelity is essential for proteome stability and for functional maintenance of cellular processes. Indeed, under normal physiological conditions, mistranslation occurs at frequencies that range from 10-3 to 10-5 errors per codon decoded. Situations where this basal error frequency increases are usually associated to aging and disease. However, there are some organisms where genetic code errors occur naturally at high level, suggesting that mRNA mistranslation can somehow be beneficial. In order to study the cellular response to mRNA mistranslation, we have engineered single codon mistranslation in yeast cells, using constitutive expression of mutant tRNASer genes. These mistranslating strains inserted serines at leucine-CUG sites on a proteome wide scale due to competition between the wild type tRNALeu with the mutant tRNASer. Such mistranslation event decreased yeast sporulation, viability and mating efficiencies sharply and affected sexual reproduction strongly. High heterogeneity in cell size and shape and high instability in the genome were also observed, with the appearance of some polyploid or aneuploid cell populations. To further study the cellular and molecular basis of those phenotypes and the biology of mRNA mistranslation, we have also engineered inducible mRNA misreading in yeast and used total mRNA and polysome associated mRNA profiling to determine whether codon misreading affects gene expression. Induced mistranslation up-regulated genes involved in the general stress response, oxidative stress and in the unfolded protein response (UPR). A significant increase in reactive oxygen species (ROS) and a strong negative impact on the capacity of post-mitotic cells to re-initiate growth in fresh media were also observed. This cell viability phenotype was rescued by scavengers of ROS, indicating that oxidative stress is the main cause of cell death caused by mRNA mistranslation. This study provides strong support for the hypothesis that oxidative stress and ROS accumulation, rather than sudden proteome collapse or major proteome disruption, are the main cause of the cellular degeneration observed in human diseases associated mRNA mistranslation.

The use of biomarkers to diagnose the ecological impact of pollutants in Mediterranean rivers

Um assunto que requer atenção é a avaliação ecológica da qualidade da água de ecossistemas de água doce. Uma abordagem que surge como promissora é a biomonitorização baseada em biomarcadores, porque pode avaliar a saúde dos organismos e obter sinais de alerta precoce acerca dos riscos ambientais. Até agora, porém, o uso de biomarcadores em espécies de invertebrados, para diagnosticar danos ecológicos nos rios, é escasso. Por essa razão, existe uma necessidade urgente de desenvolver biomarcadores nas principais espécies de macroinvertebrados dos ecossistemas fluviais que são alvo de estudo. Esta tese tem como objectivo averiguar se as respostas in situ, aliadas aos biomarcadores, podem ser um método viável para avaliar os danos ecológicos de contaminantes em ecossistemas de água doce. Numa primeira fase, os biomarcadores foram usados para averiguar os mecanismos fisiológicos de adaptação genética de clones de Daphnia magna ao pesticida organofosforado fenitrothion. Numa segunda fase, os biomarcadores foram usados como ferramentas de diagnóstico de poluição em zonas ribeirinhas. Estes estudos foram realizados com três espécies-chave de macroinvertebrados: Daphnia magna, Corbicula fluminea e Hydropsyche exocellata, nos rios Besós e Llobregat e no Delta do rio Ebro (NE Espanha). Além disso, foram realizados com animais capturados nos rios, ou com ensaios de transplantes, e foram complementados com índices biológicos de macroinvertebrados e análises químicas da água e dos animais. Como os contaminantes químicos têm vários modos toxicológicos de acção e, portanto, afectam várias respostas bioquímicas dos organismos, foram analisados nas três espécies um conjunto de biomarcadores pertencentes a diferentes vias metabólicas. A abordagem experimental indica que o uso combinado de biomarcadores e outras medidas, tais como índices biológicos e testes in situ, contribui para diagnosticar os efeitos prejudiciais de contaminantes nas comunidades ribeirinhas.

Carcinoma da nasofaringe: aspectos epidemiológicos clínicos e moleculares

Após uma revisão de aspectos filogénicos, ontogénicos e embriológicos contribuindo para a estruturação anatómica e fisiológica da nasofaringe, é efectuada uma análise das características clínicas do carcinoma da nasofaringe numa população portuguesa, comparando-as com a literatura. É efectuada análise de taxa de incidência da doença, razão de géneros, frequência relativa dos diversos subtipos de acordo com a classificação OMS, acuidade relativa dos estadiamentos TMN e sobrevivência em função do tratamento. A relação entre carcinoma da nasofaringe e infecção pelo vírus de Epstein – Barr em Portugal é estudada através da análise de detecção de DNA de EBV em tecido tumoral da nasofaringe e sangue periférico de doentes com NPC e em indivíduos saudáveis. São também efectuados estudos caso-controlo no sentido de perspectivar a relevância de dois polimorfismos genéticos na susceptibilidade genética para a doença. Esta Dissertação pretende ainda contribuir para a compreensão dos mecanismos biológicos de CN e a sua relação com o EBV numa região não endémica de baixo risco, como é Portugal, realçando a relevância da definição de um perfil biológico preditivo para o desenvolvimento de CN na população portuguesa.

Abordagem neuropsicológica das alterações na atenção e memória no sindroma de Burnout

O sindroma de Burnout, quadro psicofisio-patológico tem sido objecto de investigação intensiva, desde o artigo de Freudenberger (1974) intitulado "Staff Burnout", com dois objectivos: compreendê-lo melhor, através de meios de diagnóstico, e criar técnicas de intervenção terapêutica. Na realidade, desde essa altura, foram efectuados e publicados um número avultado de trabalhos de investigação, nos campos do diagnóstico e caracterização do Burnout, e da sua resolução terapêutica. O pensamento dominante, nessa altura e ainda hoje, é de tendência analítica e/ou psico-social. Este quadro, espoletado por uma sucessão de episódios emocionalmente negativos em contexto ocupacional em indivíduos com provável predisposição genética e sujeitos a situações de pressão laboral, dos mais diversos tipos (podendo ir do “simples” stress por acumulação de tarefas até às situações de mobbing), tem efeitos frequentemente dramáticos ao nível da dinâmica biopsico- social, nos seus mais diversos aspectos. Estes estendem-se, quase sempre, muito para lá das problemáticas laborais, prejudicando, de forma mais ou menos grave, as interacções sociais com particular impacto ao nível da dinâmica familiar. Por outro lado, o Burnout propicia o aparecimento de patologias diversas, já que toda a estrutura psiconeuro-endocrino-imunulógica estará posta em causa, potenciando situações de fragilidade sistémica. No entanto, há aspectos correlacionáveis com este quadro disfuncional que têm sido muito pouco abordados – alterações cognitivo-operativas ou neuropsicológicas. Aliás os trabalhos que sobre eles incidem são em número muito reduzido. Assim após termos registado queixas, acentuadas, ao nível da capacidade de concentração e da memória em pessoas com burnout observadas na clínica hospitalar e privada, decidimos investigar estas situações, usando uma metodologia clínica de tipo qualitativo, e constatámos que, na realidade, as queixas eram pertinentes. Posto isto, achámos que a situação deveria ser aprofundada e partimos para um trabalho mais sistematizado, este, com o objectivo de caracterizar melhor o tipo de disfunções atencionais e mnésicas. Para isso, após uma selecção prévia, a partir de um grupo de 192 enfermeiros que responderam à Escala de Maslach, avaliámos uma amostra de risco constituída por 40 enfermeiros e enfermeiras, de Instituições Psiquiátricas da Grande Lisboa, trabalhando em urgência e enfermaria, que comparámos com uma amostra de igual número de enfermeiros, desenvolvendo a sua actividade na consulta externa ou em ambientes mais protegidos de stress ocupacional continuo. Para o efeito, e após uma anamnese cuidada, aplicámos provas de atenção e memória, sensíveis a qualquer tipo de compromisso encefálico seja ele funcional ou patológico. Para a componente atenção/concentração e a componente vísuo-grafo-espacial usámos a prova de Toulouse-Piéron, assim como as séries de dígitos ou digit span, para a vertente audio-verbal. A dinâmica mnésica foi avaliada através da prova de memória associativa (Escala de Memória de Wechsler) para testar a variante áudio-verbal, e a reprodução de figuras (Escala de Memória de Wechlser). Os resultados, após uma dupla análise clínica e estatística, comprovaram globalmente as hipóteses, indicando uma correlação significativa entre o grau de Burnout e os défices neuropsicológicos detectados: alteração da atenção/concentração e dismnésia, de natureza limitativa face às exigências quotidianas dos indivíduos. Finalmente, com base na revisão da literatura e os resultados deste estudo, foi esquematizado um Modelo Neuropsicológico do sindroma de Burnout, que nos parece espelhar as relações entre este quadro clínico, as alterações cognitivooperativas encontradas e as principais estruturas encefálicas, que julgamos, implicadas em toda a dinâmica do processo disfuncional.